مقدمه. 1

 آنالوگ مداری الکتریکی سطح مشترک نورون‌ها/الکترود‌ها 1

 تزویج الکتریکی بین دستگاه و نورون. 1

 فعالیت نورون‌ها که الکترود‌های ورودی را در بر گرفته است.. 1

 نانوستون‌ها برای ثبت‌های درون سلولی و تحریک‌ها 1

 ثبت‌های میان سلولی با استفاده از منفذ سازی‌های الکتریکی. 1

 غلبه بر محدودیت‌های امپدانسی نانو ستون‌ها 1

 تکنولوژی‌های MEA ‌های صفحه‌ای گیره‌ای – اتصالی. 1

 جمع بندی.. 1

مقدمه

هدف اصلی علوم عصبی در حال حاضر درک کردن روابط بین نقشه‌های اتصالی در مدار‌های عصبی و عملکرد‌های فیزیولوژیک و یا آسیب شناسی آن‌ها می‌باشد. در حال حاضر،‌این هدف به نظر غیر ممکن می‌باشد زیرا تکنولوژی‌های الکترو فیزیولوژی در حال حاضر تنها، امکان ثبت پتانسیل‌های گروه‌های بسیار بزرگ از سلول‌ها به صورت خارج سلولی را‌ایجاد می‌کند و نمی‌توان برای بررسی ثبت‌های میان سلولی به صورت همزمان در فعالیت‌های عصبی تعداد محدود تر نورون از‌این روش‌ها استفاده کرد. علاوه بر‌این، به دلیل ناپایداری مکانیکی، الکترود‌های شیشه‌ای میان الکترودی را نمی‌توان برای نظارت‌های طولانی مدت الکترو فیزیولوژیک استفاده کرد. به همین دلیل باید یک سیستم‌ایده آل چند واحدی بتواند اطلاعاتی را فراهم کند که مجموعه‌ای از نورون‌ها را همزمان در کنار نورون‌های منفرد از نظر الکترو فیزیولوژی بررسی کند.‌این اطلاعات شامل پتانسیل‌های عمل(AP‌ها)، تحریک‌های زیر آستانه – و پتانسیل‌های پس سیناپسی و سرکوب کننده (ESPS‌ها و IPSP‌ها) نوسان‌های زیر آستانه غشا می‌باشد. بعلاوه این سیستم‌ها باید بتواند فعالیت‌های نورون‌های منفرد را در شبکه با کاربرد‌های جریانی، تنظیم و تعیین کند.

روش‌های موجود برای ثبت فعالیت‌های نورونی شامل موارد زیر است: (a) ثبت‌های میان سلولی و تحریک با استفاده از الکترود‌های اتصالی و تیز، (b) ثبت‌های خارج سلولی و تحریک با استفاده از آرایه‌های ریز الکترودی بر روی بستر (MEA‌ها)، (c) تصویر برداری‌های نوری و تکنولوژی‌های تحریک برای تعیین کننده فلورسنت خارجی و یا پروب‌های مولکولی کد گذاری شده به صورت ژنتیکی و (d) دیگر روش‌ها مانند تصویر برداری رزونانس مغناطیسی عملکردی، الکتروانسفالوگرافی،الکتروکورتینوگرافی و مگنت‌وانسفالوگرافی که برای ثبت فعالیت‌های جمعیت‌های بسیار زیاد نورون‌ها طراحی شده است که برای کاربرد‌هایی با تفکیک یک نورون مناسب نمی‌باشد. اختراع ثبت‌های میان سلولی و تکنولوژی‌های تحریک توسعه‌های بسیار مهمی بودند که متخصصان زیستی را قادر ساختند تا در مورد فعالیت‌ها و انتقال‌های عصبی در میان نورون‌های منفرد و محاسبه سرحد‌های سیناپسی، اطلاعات کسب کنند. قدرت سیستم‌های ثبت میان سلولی‌این است که آن‌ها تزویج‌های الکتریکی با سلول‌ها فراهم می‌کنند و ثبت بسیار دقیقی از کل گستره دینامیک ولتاژ‌های‌ایجاد شده توسط سلول‌ها بدون‌ایجاد اخلال در طول زمان، فراهم می‌کنند. با‌این وجود، استفاده از ریز الکترود‌های تیز و اتصالی محدود به نورون‌های منفرد است زیرا نوک هر الکترود به سمت یک سلول هدایت شده و‌این کار نیازمند استفاده از نفوذ کننده‌های زیاد و نیز زمان جلسه‌های ثبت پتانسیل‌ها محدود به ناپایداری‌های مکانیکی و زیستی می‌شود.

در مقابل، در حالی که استفاده از MEA‌های غیر تهاجمی برای ثبت‌های محیط مصنوعی و الکترود‌های چند تایی برای ثبت‌های درون تا حد زیادی سیگنال‌ها را ضعیف کرده و فیلتر زمانی‌ایجاد می‌کند، ‌این الکترود‌ها ما را قادر می‌سازند تا به صورت همزمان ثبت و تحریک گروه‌های زیادی از سلول‌های تحریک پذیر را به مدت روز‌ها و یا ماه‌ها بدون آسیب مکانیکی به غشای پلاسمایی نورون‌ها انجام دهیم. ثبت پتانسیل‌های میدان‌های خارج سلولی ( که به صورت مبهم به آن‌ها پتانسیل‌های میدان موضعی(LEPها)و یا پتانسیل‌های میدان(FP‌ها) گفته می‌شود) نشان دهنده فعالیت‌های نیزه‌ای نورون‌های منفرد و یا مجموع AP‌ها بسیار سریع، پتانسیل‌های سیناپسی و پتانسیل‌های کند گلیالی در تفکیک‌های زمانی و مکانی می‌باشد. به دلیل‌ این که روندهای فیزیکی که موجب‌ایجاد FP‌ها می‌شود درک شده است، از لحاظ نظریاتی می‌توان منابع آن‌ها را بازسازی کرد. حتی با وجود ‌اینکه بخش زیادی از اطلاعات را می‌توان با استفاده از چند الکترود‌ها دست آورد، اطلاعات استخراج شده در مشخصه‌های متمایز الگوهای نیزه‌ای محدود است. به عنوان مثال، طبقه بندی‌های شدید نیزه‌ای نمی‌توانند اطلاعاتی در مورد‌این که ‌ایا تحریک یک نورون در اثر مکانیزم‌های درونی‌ایجاد شده، و یا‌این که مجموعه از ورودی تحریک وارد شده یا توقف سرکوب‌ایجاد شده است، برای ما فراهم کند ( جعبه1) چه چیزی فعالیت یک نورون را متوقف می‌کند؟‌ایا مجموعه‌ای از ورودی‌های سیناپسی سرکوب کننده، توقف ورودی‌های تحریکی و یا ‌هایپرپلاریزاسیون پتانسیل غشا توسط مکانیزم‌های درونی موجب توقف فعالیت نورون‌ها می‌شود؟ نورون‌هایی که در طول جلسه‌های ثبت AP‌ها را فعال نمی‌کنند برای الکترود‌های خارج سلولی قابل مشاهده نیستند( به آن‌ها نورون‌های تاریک گفته می‌شود : جعبه شماره1). در بعضی از نواحی مغزی، 90% از نورون‌ها فعال نیستند و یا‌ این که با نرخ بسیار پایینی مثلا کمتر از 0.16 ضربه در هر ثانیه فعالیت می‌کنند ( برای بررسی بیشتر به مرجع 12 نگاه کنید). ثبت‌های میان سلولی پتانسیل‌های سیناپسی از‌این نورون‌ها می‌تواند اطلاعات بسیار زیادی را، مانند نقش اکثریت غیر فعال نورون‌ها در پردازش اطلاعات و اهمیت نورون‌ها در رفتار شبکه عصبی، در اختیار ما قرار دهد. بخش زیادی از انعطاف‌های نورونی مرتبط با تغییرات در دامنه پتانسیل‌های سیناپسی می‌باشد. در صورتی که‌این تغییرات به سرحد فعالیت نرسد، سیستم‌های ثبت خارج سلولی نمی‌توانند‌این رخداد‌های مهم را ثبت کنند. سیگنال دهی محسوسی بین نورون‌ها وجود دارد که پتانسیل‌های زیر سرحد بر روی آن‌ها تاثیر دارد( سیناپس‌های شیمیایی و یا الکتریکی) و ازین رو با استفاده از الکترود‌های سیستم‌های خارجی ثبت آن‌ها غیر ممکن است.

به دلیل توسعه اولین MEA، تلاش‌های فنی انجام شده است تا کیفیت اطلاعات به دست آمده با استفاده از ثبت‌های خارج سلولی بهبود پیدا کند که بیشتر ‌این کار‌ها با افزایش تراکم و تعداد الکترود‌ها انجام شده است که می‌توان آن‌ها را بر روی یک MEA اجرا کرد. در محیط مصنوعی MEA‌ها دارای بیشتر از 10000 الکترود هستند. در حالت محیط طبیعی بدن‌این آرایش‌ها می‌توانند بیش از صد الکترود داشته باشد. در هر صورت، ثبت‌ها و کیفیت‌های شبیه سازی‌این پلت فرم‌ها(که توسط ضریب‌های تزویج بین نورون‌های منفرد و دستگاه و نسبت سیگنال به نویز منعکس می‌شود) هنوز ضعیف است. معمولا دامنه‌های گستره FP‌ها بین 10ⴄV تا 1mV است و بخش زیادی از توان محاسباتی برای استخراج اطلاعات و دسته بندی سیگنال‌های ثبت شده مورد نیاز می‌باشد.

در موازات توسعهMEA‌های خارج سلولی، تلاش‌هایی برای توسعه روش‌های تصویر برداری نوری نیز انجام شده است.‌این تلاش‌ها شامل تصویر برداری از پتانسیل‌های غشا با استفاده از رنگ‌های حساس به ولتاژ، تصویر برداری از فعالیت نورون‌ها با نظارت بر تغییرات در غلظت آزاد کلسیوم و نظارت بر سیگنال‌های داخلی سلول‌ها می‌باشد.‌این کار با استفاده از روش‌های قوی انجام شده است تا بتوان نورون‌ها را به صورت نوری تحریک و یا سرکوب کرد و یا بتوان بررسی‌هایی روی آن‌ها انجام داد. روش‌های قوی تصویر برداری نوری چندین محدودیت دارند که در حال حاضر مانع‌این می‌شود که از‌این روش‌های نوری به جای روش‌های الکتروفیزیولوژی در مطالعه شبکه‌های عصبی استفاده کرد ( برای مباحث بیشتر به مرجع شماره34 نگاه کنید). با استفاده از تکنولوژی‌های نانو و میکرو، تعدادی از آزمایشگاه‌ها شروع به کار بر روی ترکیب ویژگی‌های تکنولوژی‌های خارج سلولی MEA مجتمع بر روی بستر، با فواید الکترود‌های میان سلولی کرده اند. اصطلاحا، ساختار‌این دستگاه‌های نانو و یا میکرو که امکان ثبت همزمان، طولانی مدت، چند جایگاهی و درون سلولی را همراه با تحریک سلول‌ها برای بسیاری از نورون‌ها در شرایط آزمایشگاهی فراهم می‌کند، بسیار اهمیت دارد. توسعه‌های بیشتر و اجرای‌این تکنولوژی‌ها می‌تواند مبنا و روش‌های علوم عصبی را متحول کند. در‌این بررسی ما توسعه‌های اخیر در‌این زمینه را ارائه میدهیم که فواید مورد انتظار از کاربرد آن‌ها و محدودیت‌های پیش بینی شده در روش‌های مربوطه را نیز ارائه می‌دهیم. ما‌ این توسعه‌ها را از نظر کاربر نهایی بررسی می‌کنیم نه از نظر فنی. با در نظر داشتن نیاز‌های علوم مدار‌های عصبی در یک طرف و توسعه‌های فنی از طرف دیگر در ساخت MEA در طرف دیگر، ما تلاش داریم تا تمرکز خودمان را در مورد توسعه‌های فنی از بهینه سازی مهندسی رفتاری به بررسی نیاز‌های علوم عصبی تغییر دهیم.

برای ارزیابی هدفند روش‌های مختلف، ما دست آورد‌های اصلی مرتبط با پارامتر‌های زیستی را بررسی میکنیم که برای کسب اطلاعات در مورد نقشه‌های اتصالات مغزی در شبکه‌های عصبی، مورد نیاز هستند. یک دستگاه‌ایده آل موهومی به کاربران‌این امکان را میدهد تا : (a) به صورت همزمان صد‌ها نورون منفرد را به صورت همزمان مورد ثبت و تحریک قرار دهند ، (b) یک سطح تماس پایدار با نورون‌ها برای ثبت و تحریک برای روز‌ها و ماه‌ها‌ایجاد می‌کند، (c) پتانسیل‌های غشایی را که مربوط به گستره‌های فیزیولوژیکی سلولی از گستره-80 تا +30 mV هستند را مورد نظارت قرار میدهد، (d) پتانسیل‌های زیر سرحد مانند فعالیت‌های سیناپسی سرکوب کننده و تحریک کننده را با دامنه‌هایی در حد -10mV +_0.5 با زمان خیز کمتر از 1ms شناسایی کرده و زمان نقصان کند 100-1000ms را نشان میدهد و می‌تواند نوسان‌های غشایی را در گستره+-5mV با فرکانس 1-50Hz شناسایی می‌کند و (e) AP‌هایی با دامنه100mV˜ و زمان 1-500ms را ثبت می‌کند( AP‌ها طولانی بر ثبت از کاردیومیوسیت‌ها)

برای‌این که خواننده‌ها بتوانند با لغت‌های اصلی که در‌این زمینه مورد استفاده قرار گرفته است آشنا شوند و بتوانند یک مقدمه فنی نسبت به بحث داشته باشند، ابتدا با توصیف ساختار و رابطه‌های الکتریکی بین نورون‌ها و MEAهای مجتمع شده بر روی بستر شروع میکنیم و سپس تاثیر پارامتر‌های مختلف را در تزویج‌های الکتریکی بین سلول‌های تحریک پذیر (نورون‌ها و کاردیومیوسیت‌ها) و MEA‌ها را به صورت خلاصه توضیح میدهیم. سپس ما روش‌های میکرو و نانو را که اخیرا برای ترکیب MEA‌های خارج سلولی با الکترود‌های شیشه‌ای تیز استفاده شده است را توصیف میکنیم و سپس مشکلات اصلی که باید برای روش‌های جدید رفع شود را بیان میکنیم تا بتوانیم در کاربرد‌های تحقیقاتی و بالینی از‌این روش‌ها استفاده کنیم. بر اساس‌این بحث ما یک دستور آزمایشی ارائه میدهیم که ما باور داریم می‌تواند یک روش بهینه برای‌ایجاد یک MEA‌ایجاد کند که بتواند ثبت‌ها و تحریک‌های همزمان، طولانی مدت و چند جایگاهی را از به صورت میان سلولی از نورون‌های مختلف‌ایجاد کند.

آنالوگ مداری الکتریکی سطح مشترک نورون‌ها/الکترود‌ها

رابطه ساختاری بین نورون‌ها و صفحه الکترود‌های مجتمع بر روی بستر الکترود در کنار مدار‌های الکتریکی آنالوگ به صورت شماتیک در شکل 1 نشان داده شده است. ترکیب نوروالکترونیک از سه بخش تشکیل شده است (a) نورون، (b) شکاف‌ایجاد شده بین نورون‌ها و سطح بستر و (c) الکترود‌ها. معمولا، نورون‌های متمایز ساختار‌های غیر هم پتانسیل هستند که یک بدنه سلولی دارند; که به صورت درخت‌های دندریتی شکل میگیرد و یک زائده بلند آکسونی استوانه‌ای دارد.‌این بخش‌های مختلف نورونی به بستر MEA با تعامل‌های الکتروالاستیک و یا شیمیایی متصل میشوند که‌این اتصال بین مولکول‌های چسبنده‌ایجاد می‌شود که از غشای لیپیدی از نورون‌ها و مولکول‌هایی که بر روی صفحه‌های MEA رسوب داده شده است بیرون زده است. شکاف بین غشای سلول‌ها و بستر MEA با محلول‌های یونی پر می‌شود. برای مدل ساده شده‌ای که در شکل 1 نشان داده شده است، سطح نورون‌ها به قسمت‌های زیر تقسیم می‌شود : یک غشای اتصالی که پد حسگر در تماس با آن است، (با R_i به عنوان مقاومت‌های اتصالی)،و غشای غیر اتصالی (با R_ni به عنوان غشای غیر اتصالی) که در تماس با بستر و حمام محلول می‌باشد. انتشار AP‌ها و یا پتانسیل‌های سیناپسی جریان خارج سلولی بین بخش‌های فعال شده و دیگر بخش‌های نورون‌ایجاد می‌کند. کسر‌هایی از‌این جریان‌های خارج سلولی بین بخش غشای اتصالی و غیر اتصالی جریان پیدا می‌کند.‌این شکاف که بین نورون‌ها و المان‌های حسگر‌ایجاد می‌شود، یک مقاومت‌ایجاد می‌کند که به آن مقاومت بست R_seal میگویند. ولتاژ‌های‌ایجاد شده بر روی R_seal به صورت مستقیم ولتاژ گیت ترانزیستور تاثیر میدان (FET) را تنظیم کرده و یا به طور مستقیم بر بر روی الکترود‌های فلزی بار پراکنده‌ایجاد می‌کند.

تزویج الکتریکی بین دستگاه و نورون

تزویج بین نورون و یا یک کاردیومیوسیت و یک پد حسگر در‌این جا به عنوان نسبت بین بیشترین ولتاژ ثبت شده توسط دستگاه در پاسخ به بیشترین ولتاژ‌ایجاد شده توسط یک سلول تحریک پذیر تعریف می‌شود. شکل 2 نشان میدهد که پارامتر‌های منفرد یک مدار آنالوگ الکتریکی منفعل بر روی ضریب‌های تزویج نوسان‌های آرام غشا، پتانسیل‌های فرکانس متوسط سیناپسی و AP‌های سریع(شکل2a) تاثیر دارد. پارامتر‌های مورد استفاده برای شبیه سازی‌ها ویژگی‌های منفعل فیزیکی یک سلول تحریک پذیر را که بر روی یک الکترود مجتمع بر روی بستر پرورش یافته است را تخمین میزند (شکل 2a). شبیه سازی رخداد‌های ولتاژی در فرکانس‌های مختلف نشان میدهد که ضریب تزویج برای فرکانس‌های بالاتر AP‌ها در مقایسه با پتانسیل‌های پس سیناپسی و نوسان‌های غشایی تضعیف بیشتری دارد(شکل 2b و3)

شکل 1 طرح شماتیک نشان دهنده رابطه فضایی بین یک نورون و الکترود‌های مجتمع بر روی بستر و مدار الکتریکی منفعل 

بدنه سلول یک نورون( آبی کم رنگ) بر روی قسمت حسگر الکترود(نارنجی) که در یک بستر کشت یکپارچه شده است(زرد) قرار میگیرد. الکترود‌ها با یک تقویت کننده تزویج شده است(زرد). یک شکاف بین واسط کشت (محلول یونی) بین غشای سلول و بستر الکترود قرار میگیرد. غشای پلامایی نورون‌ها به دو قسمت تقسیم می‌شود: قسمت اول که رو به روی الکترود(آبی) بوده که به عنوان غشای اتصالی معرفی شده و توسط مقاومت اتصالی غشا و رسانش غشای اتصالی C_i تعریف می‌شود. بقیه غشا به صورت غشای غیر اتصالی تعریف می‌شود(قرمز) که با حمام محلول و بستر کشت در ارتباط است. ‌این بخش از غشا با مقاومت غیر اتصالیR_nj و خازن غیر اتصالی C_nj نشان داده می‌شود. محلول فیزیولوژیکی در‌این شکاف مقاومت بست R_seal را نسبت به زمین‌ایجاد می‌کند. امپدانس الکترود(نارنجی) با مقاومت الکترود و خازن(به ترتیب _REو C_e ) نشان داده می‌شود. الکترود‌ها می‌توانند المان‌های منفعل و یا ترانزیستور باشد. برای هدف شبیه سازی AP‌ها و تزریق‌های جریان‌های میان سلولی،‌این جریان را می‌توان مدار سلولی آنالوگ بین R_nj و R_ji تعریف کرد. تحت شرایط فیزیولوژیک جریان توسط تغییرات گذرا در رسانش غشا‌ ایجاد می‌شود. رنگ‌های کد کننده که در‌این شکل 4 نشان داده شده است برای نشان دادن بخش‌های مختلف مدار آنالوگ الکتریکی می‌باشد.

ملاحظات نظریاتی و آزمایشی نشان داد که به صورت کاهشی، دامنه و شکل FP‌ها توسط چند برابرسازی مقدار R_seal توسط جریانی که از آن عبور می‌کند، (شکل 2c)‌ایجاد می‌شود. به همین دلایل، تلاش‌های زیادی انجام شده است تا مقدار R_seal افزایش پیدا کند. بیشتر‌این تحقیقات تنها توانسته اند اندکی نسبت سیگنال به نویز در دستگاه‌های مختلف را بهبود دهند. مطالعه سطح مشترک سلول و الکترود نیز نشان داد که ضخامت معمول شکاف بین 40-100nm می‌باشد. برای بیشتر انواع سلول‌ها‌این موضوع متناظر با R_seal در حد 1-2 MΩ می‌باشد در نتیجه ثبت‌های FP نیز در حد چند ده تا چند صد میکرو ولت می‌باشد.

یکی دیگر از عواملی که به صورت موثر بر روی ضریب تزویج بین سلول‌ها و یک MEA تاثیر دارد، امپدانس ورودی پد‌های حسگر می‌باشد (شکل 1 و شکل 2d). جریان‌های سلول‌های زنده و دستگاه‌های الکترونیکی در اصل نسبت به هم متفاوت هستند: مورد اول توسط یو نهایی‌ایجاد می‌شود که در محلول قرار دارند در حالی که جریان دوم توسط الکترون‌هایی‌ایجاد می‌شود که معمولا در مواد جامد فلزی و یا نیمه رسانا‌ها هستند. انشعاب‌های‌این تفاوت تاثیر امپدانس دستگاه بر روی تزویج الکتریکی است که توسط حالت هندسی پد حسگر و مواد سازندهآن، تعیین می‌شود. معمولا امپدانس پد حسگر که یا از فلزات نجیب و یا نیمه رسانا‌های عایق ساخته شده است، معمولا به دو لایه‌ای یونی بلوکه کننده‌ای نسبت داده می‌شود که در ناحیهفعال دستگاه و محلول یونی‌ایجاد می‌شود که نورون‌ها در آن قرار دارند.

شکل 2 شبیه سازی تاثیر اجزای الکتریکی منفرد بر روی ضریب تزویج الکتریکی نورون‌ها و الکترود‌ها

سمت چپ، مدار آنالوگ منفعل و پارامتر‌های معمول مورد استفاده برای شبیه سازی مدار الکتریکی آنالوگ منفعل. سمت راست : شبیه سازی‌ها برای سیگنال‌های کم فرکانس که نشان دهندهنوسان‌های غشا، سیگنال‌های فرکانس متوسط که نشان دهنده پتانسیل‌های پس سیناپسی(PSP‌ها) و فرکانس‌های سریع نشان دهندAP‌ها انجام شده است. C_amp خازن ورودی تقویت کننده؛ Z_stau امپدانس گذرا می‌باشد. برای شبیه سازی، تمام پارامتر‌های ییش فرض همانطور که در (A) نشان داده شده است ثابت هستند در حالی که پارامتر‌های تست شده در گسترهمشخص شده توسط محور افقی b-g تغییر می‌کند. ضریب تزویج به عنوان تابعی از : فرکانس پالس ولتاژ(b) مقاومت بست (c)، امپدانس پس حسگر (d) مقاومت غشای اتصالی (e)، مقاومت غشای غیر اتصالی (f) و خازن گذرا (g) نشان داده شده است. شبیه سازی‌ها بر اساس مرجع 64 و 65 انجام شده است.

به عنوان مثال، الکترود‌های استاندارد صفحه‌ای از جنس طلا با شعاع 30um معمولا دارای امپدانس 50KΩ در 1KHz در محلول‌های الکترولیت هستند. با کاهش مساحت سطحی هر کدام از پد‌های حسگر برای تطابق با ابعاد هر کدام از نورون‌ها، می‌توانیم تراکم کافی در MEA‌ایجاد کرده و تفکیک فضایی آن را افزایش دهیم. البته‌این کار موجب کاهش دامنه‌های FP می‌شود زیرا امپدانس افزایش پیدا کرده و در نتیجه نسبت سیگنال به نویز نیز کاهش پیدا می‌کند. ازین رو، حالت هندسی الکترود‌ها و امپدانس‌های‌ایجاد شده هر دو بر روی کاهش سایز الکترود‌ها تاثیر دارند. افزایش مساحت سطحی با استفاده از نانوساختار‌ها مانند پلاتینیوم‌های اسفنجی و یا Ti₃N₄ و نانوستون و یا نانو ساختار‌های طلا، و یا نانولوله‌های کربنی نیز برای مطابقت با ابعاد الکترود‌های سطحی برای حس کردن سلول‌ها استفاده می‌شود. با وجود‌این که‌این روش‌ها در کاهش امپدانس تا حد 95 % در فرکانس 1KHz موفق هستند، در عمل FP‌های ثبت شده هنوز در گسترهصد میکرو ولت هستند.‌این موضوع بیشتر به‌این دلیل است که جریان‌های پیچیده منفی و مثبت که توسط تعدادی از منابع به صورت همزمان تولید می‌شود با هم جمع شده و در کسر‌های مساحت سطحی زیادی از الکترود با هم تاثیر میگذارند.‌این خاصیت میانگین گیری معمولا موجب می‌شود که دامنهثبت‌های الکتریکی کاهش پیدا کند. البته باید به‌این نکته توجه داشت که کاهش در امپدانس‌های الکتریکی می‌تواند در بهبود سیگنال‌های ثبت شده در شرایطی که یک سلول یک الکترود را به صورت کامل پوشش میدهد، مانند شرایطی که در‌این مطالعه توصیف شده است، می‌تواند بسیار مفید باشد(شکل 4).

غشای اتصالی به عنوان مقاومت و خازن غشا تعریف می‌شود که در تماس با پد‌های حسگر و یا دروازهFET میباشند (شکل 1). مساحت سطحی غشای اتصالی می‌توان کسر بسیار کمی از مساحت سطحی سلول باشد و یا‌این که می‌تواند در سلول‌های صاف 50 % غشا را شامل شود که بسیار قوی به پد‌های حسگر که در بستر قرار گرفته اند، متصل شود.‌این متغیر مبتنی بر حالت هندسی پد‌های حسگر و شکل و ویژگی‌های چسبندگی سلول‌ها می‌باشد. غشای اتصالی ازین رو می‌تواند دارای مقاومت بسیار بالا و خازن بسیار کم باشد.‌این یعنی که تنها کسر کمی از جریان‌ایجاد شده در غشای نورون‌ها، در غشای اتصالی جریان پیدا می‌کند. کاهش مقاومت غشای اتصالی می‌تواند یکی از راه‌های مهم در بهبود ضریب تزویج الکتریکی بین نورون‌ها و الکترود‌ها شود ( شکل 2a و شکل 3). در واقع‌این روشی است که توسط راه‌های قدیمی در الکترود‌های تیز، الکترود‌های اتصالی به کل سلول و یا پیکربندی‌های اتصالی سوراخ شده(شکل 4a,b) استفاده میشده است. تلاش‌هایی انجام شده است تا بتوان ضریب تزویج الکتریکی بین سلول‌های کشت یافته و MEA‌های صفحه‌ای با استفاده از بیان کانال‌های یونی در غشای پلاسمایی را بهبود داد و‌این روش‌ها به صورت آزمایشی تاثیر رسانش غشای اتصالی را در‌این موضوع نشان داد. در هر صورت، دست کاری‌های آزمایشی برای بهبود تزویج الکتریکی با بیان کانال‌های یونی در نورون‌ها را نمی‌توان در مطالعه شبکه‌های نورونی مانند دست کاری‌های الکترو آناتومی سلول‌ها و تحریک پذیری آن‌ها، استفاده کرد زیرا‌این کار موجب تغییرات عملکردی در شبکه‌های مورد مطالعه می‌شود. در برخی از مطالعه‌های اخیر، افزایش‌های موضعی در رسانش غشای اتصال با منفذ سازی الکتریکی به صورت موضعی‌ایجاد شده است که به صورت گذرا موجب افزایش ضریب تزویج می‌شود ( شکل 4e). خازن‌های گذرای‌ایجاد شده در مسیر رسانش که غیر قابل اجتناب هستند، در کنار امپدانس ورودی مدار تقویت کننده، باز هم موجب کاهش سیگنال‌های ثبت شده می‌شود ( شکل 2). اخیرا، تعدادی از آزمایشگاه‌ها تلاش دارند تا فواید MEA‌های خارج سلولی را با ریز الکترود‌های درون سلولی ترکیب کنند. در پاراگراف‌های بعدی ما روش‌های جدید را توصیف کرده و نقاط قوت و ضعف آن‌ها را از نظر کاربر نهایی، بررسی میکنیم.

فعالیت نورون‌ها که الکترود‌های ورودی را در بر گرفته است

اولین مجموعه از مطالعه‌ها که به بررسی ثبت و تحریک موفق با استفاده از MEA‌ها به صورت غیر تهاجمی، چند جایگاهی و میان سلولی را گزارش داد، در آزمایشگاه ما بین سال‌های 2007 تا 2010 منتشر شد. در‌این مطالعه‌ها ما ضریب تزویج الکتریکی بین الکترود‌ها و نورون‌ها را از 0.1% که توسط MEA‌های صفحه‌ای خارج سلولی ثبت شده بود ، با استفاده از منفذ کاری‌ها با استفاده از ساختار‌های قارچی شکل طلا در سایز میکرومتر به عنوان الکترود، به 50 % رساندیم ( شکل 4d و 5a). ضریب تزویج افزایش یافته مرتبط با ثبت‌های میان سلولی از AP‌های درون سلولی تضعیف شدهمثبت تک فاز بود، و FP‌های معمول دو فاز در‌این ثبت‌ها نقشی نداشتند. پیکربندی‌های واحد الکترود – نورون که در‌این کار استفاده شده است ما را قادر ساخت تا برای اولین بار، با استفاده از MEA پتانسیل‌های عمل را در کنار پتانسیل‌های سیناپسی ثبت کنیم (شکل 5c). کلید اصلی آرایش‌های چند الکترودی در روش ثبت درون سلولی که توسط ما توسعه یافت سه اصل زیست سلولی به صورت همگرا، می‌باشد : (a)فعال سازی مکانیزم‌های مشابه اندوسیت‌ها که در‌این مکانیزم‌ها نورون‌های آپلیزیا تحریک میشوند تا ریز الکترود‌های قارچی شکل gMµEs را در بر بگیرند که‌این الکترود‌ها از یک سطح صاف بیرون آمده اند، (b)‌ایجاد R_seal بالا بین غشای سلولی و gMµEs و (c) افزایش رسانس غشای اتصالی.

سطح مشترک نورون‌ها و‌این الکترود‌ها با استفاده از تحریک نورون‌ها برای در بر گرفتن الکترود‌های gMµEs ‌ایجاد می‌شود که‌این الکترود‌ها در فضا‌های زیستی کاملا پایدار هستند – همچنین در مکانیزم‌های اندوسیتی که برای از بین بردن عوامل خارجی سلولی استفاده می‌شود نیز‌این الکترود‌ها پایدار هستند. شکل و ابعاد gMµEs ‌ها به گونه‌ای انتخاب شده است تا مشابه با دندانه‌های دندریتی باشد. برای تسهیل روند در برگرفتن نورون‌ها، gMµEs به صورت شیمیایی توسط پپتید‌های مبتنی بر RGD‌ها طراحی شده است.‌این پپتید یکی از گروه‌های شناخته شدهسلولی بوده که موجب تحریک مکانیزم‌های بلعیدن در سلول‌ها می‌شود. ارائهموضعی‌این پپتید‌ها توسط الکترود‌های gMµEs ( و احتمالا توسط حالت هندسی الکترود) موجب می‌شود که‌این حالت بلعیدن توسط الکترود‌ها در نورون‌های آپلیزیا و تعدادی دیگر از سلول‌ها‌ایجاد شود. در بر گرفتن‌این الکترود‌ها به‌این صورت توسط آبشار‌های مولکولی اجرا می‌شود که شامل بازسازی اسکلت سلولی‌هایی می‌شود که برای‌ایجاد یک حلقهاکتینی اطراف الکترود‌های قارچی شکل ( شکل 4d و 5a سمت چپ) می‌باشد.

با استفاده از پارامتر‌های زیست فیزیکی به دست آمده از اندازه گیری‌های مستقیم از مقاومت و خازن غشای غیر اتصالی، مقاومت الکترود‌ها، خازن الکترود و R_seal ، در کنار مقادیر اندازه گیری شده از ویژگی‌های غشای اتصالی که بر اساس حالت هندسی الکترود‌های طلا gMµEs اندازه گیری شده است ( شکل 1)، ما ثبت‌های مورد انتظار را برای AP‌ها و پتانسیل‌های زیر سر حد با استفاده از یک مدار معادل الکتریکی، شبیه سازی کرده‌ایم . ما متوجه شدیم که مقدار‌های محاسبه شده که برای مقاومت غشای اتصالی استفاده شده است نمی‌تواند ضریب تزویج مورد نیاز را بین الکترود‌ها و نورون‌ها که به صورت آزمایشی به دست آمده بود،‌ایجاد کند.

شکل 3 وابستگی تزویج الکتریکی بر روی مقاومت غشای اتصالی و طول پالس

تصویر نشان داده شده یک شبیه سازی از تزویج سلول و دستگاه در AP‌ها و پالس‌های طولانی‌هایپر پولاریزاسیون در سه مقدار مختلفR_j(100MΩ,1GΩ and 100GΩ) می‌باشد، a یک نمایش شماتیک از دپولاریزاسیون (سمت چپ) و پالس‌های جریان‌هایپرپولاریزاسیون ( سمت راست) است که برای‌ایجاد دو AP و‌هایپرپولاریزاسیون غشایی‌ایجاد شده است. B شبیه سازی پتانسیل‌های درون سلولی‌ایجاد شده است که با استفاده از یک الکترود درون سلولی ( قرمز) ثبت شده است . c-e نیز پتانسیل‌های ثبت شده توسط یک الکترود است که خارج از سلول قرار گرفته است ( که در شکل 1 و 2 نشان داده شده است) و مقادیر مختلفی برای غشای اتصالی انتخاب شده است(آبی) . در نظر داشته باشید که دامنهAP‌های که به صورت خارجی ثبت شده است(پالس‌های کوتاه) نسبت به ولتاژ‌های‌ایجاد شده توسط پالس‌های بلند، سریع تر کاهش پیدا می‌کند. زیرا، ضریب تزویج در AP‌ها حساسیت بیشتری نسبت به مقدارR_j ، در مقایسه با پالس‌های بلند، دارد. مقادیر مورد استفاده برای شبیه سازی‌ها مشابه مقادیر شکل 2 هستند، با وجود‌این که R_j همانطور که مشخص شده، دچار تغییرات می‌شود.

برای رسیدن به سطح تزویج مشاهد شده در آزمایش‌ها ما باید رسانش غشای اتصالی را حد اقل یک برابر افزایش دهیم . مکانیزم مورد استفاده برای افزایش رسانش غشای اتصالی هنوز معلوم نیست. البته احتمالا‌این افزایش به دلیل‌ایجاد اسکلت‌های سلولی اطراف الکترود‌ها، کانال‌های یونی مستقل از ولتاژ هستند که در غشای اتصالی‌ایجاد می‌شود و در نتیجه موجب افزایش رسانش غشای اتصالی بدون تاثیر بر ویژگی‌های فعال و منفعل غشا، می‌شود. یک توضیح دیگر نیز می‌تواند‌این باشد که تنش‌های مکانیکی‌ایجاد شده در محل انحنای gMµEs موجب می‌شود که منفذ‌های بسیار کوچک در غشا‌ایجاد شود. یک سوال مهم در‌این جا‌این است که‌ایا رشد نورون‌های آپلیزیا بر روی ماتریس‌های gMµEs موجب تغییر در ویژگی‌های نورون‌ها می‌شود یا خیر. ما متوجه شده‌ایم که رشد نورون‌ها بر روی gMµEs موجب تغییر در ویژگی‌های زیستی نورون‌ها و یا اتصالات سیناپسی آن‌ها نمی‌شود. البته گاهی الگو‌های رشد نورون‌ها را تغییر میدهد.

شکل 4 شکل‌های مختلف از پیکر بندی سطح مشترک بین الکترود و نورون

کد‌های رنگی نشان داده در‌این جا مشابه کد‌های رنگی شکل 2 می‌باشد. A یک ریز الکترود تیز شیشه‌ای، B یک پیکربندی اتصال کل سلول به الکترود. ترکیب شماتیک قسمت آبی و نارنجی نشان دهندهنفوذ به سیتوزول‌ها توسط محتویات الکترود‌ها می‌باشد. C یک نورون که بر روی یک صفحه الکترودی قرار گرفته در بستر کشت یافته است. در نظر داشته باشید که شکاف (سفید) جدا کنندهغشای اتصالی و الکترود‌ها چگونه است. D یک نورون یک الکترود‌های قارچی شکل طلا را ( ریز الکترود‌ها) در بر گرفته است. حلقه‌های اکتینی اطراف الکترود که موجب پایدار شدن پیکربندی می‌شود را مشاهده کنید. E الکترود‌های نانو ستون‌ها که در کاردیومیوسیت‌ها وارد شده است اما به غشای پلاسمایی نفوذ نکرده است (i) . بعد از استفاده از پالس‌های منفذ سازی الکتریکی(ii)، نانوستون‌ها به سیتوپلاسم دسترسی پیدا میکنند.‌این منفذ سازی الکتریکی گذار بوده و در طول چند دقیقه مقاومت غشای اتصالی دوباره به حالت قبل باز میگردد (iii) f آرایه‌ای از نانو ستون‌ها وارد غشای پلاسمایی شده و یک اتصال فیزیکی مستقیم با سیتوزول‌ایجاد میکنند. G یک نانو ستون که به عنوان دروازهنانو FET‌ها کار می‌کند وارد غشای سلولی می‌شود h اتصال نورون‌های کشت یافته. ترکیب محلول یونی سیستم‌های ریز سیل با سیتوزول‌ها نیز نشان داده شده است. برای جزئیات دقیق تر به متن مراجعه کنید.

تحریک‌های سلول‌ها با استفاده از الکترود‌های یکپارچه شده در بستر(یا الکترود‌های منفعل فلزی و یا FET‌ها) معمولا شامل محصولات واکنش‌های الکتروشیمیایی در سطح مشترک الکترود‌ها بوده و در نتیجه بر روی سلول‌هایی که تحت منفذ سازی الکتریکی موضعی قرار میگیرند، تاثیر دارد. اندازه گیری‌های مقاومت ورودی نورون‌ها قبل و بعد از تحریک توسط gMµEs هیچ تغییر نداشته که‌این موضوع تایید می‌کند که می‌توان انتقال بار کافی را برای تحریک AP‌ها بدون آسیب به سلول‌ایجاد کرد.

از میان 5 معیار برای ارزیابی فواید‌این روش‌ها، MEA‌های مبتنی بر gMµEs ‌ها می‌توانند برای دوره‌های چند روزه ثبت و تحریک‌های چند جایگاهی، همزمان و میان سلولی را فراهم کند (که به مدت زمانی است که ما ثبت‌ها را انجام دادیم). ویژگی‌های فیلتر سازی الکترود‌های طلا و تقویت کننده‌های a.c. مورد استفاده امکان ثبت پتانسیل استراحت نورون‌ها را‌ایجاد نمی‌کند. در هر صورت، پیکربندی‌های ارائه شده می‌تواند به صورت موفق پتانسیل‌های سیناپسی زیر سرحد و AP‌ها را نظارت می‌کند ( شکل 5c در قسمت وسط).

 شکل 5 دستگاه‌های MEA که اخیرا توسعه یافته است، پتانسیل‌های درون سلولی را از سلول‌های تحریک پذیر ثبت می‌ کنند.

 ریز الکترود‌های قارچی شکل طلا (gMµEs) که با پپتید‌های مبتنی بر RGD تغییر عملکرد یافته است ( بالا سمت راست، میکروسکوپ‌های اسکن الکترونی(SEM)) همانطور که میبینید‌این الکترود‌ها توسط نورون‌ها در بر گرفته شده است( تصویر سمت راست، تصویر‌های انتقال الکترونی ) که همین موضوع موجب سازماندهی مجدد اسکلت سلولی اطراف ساختار الکترود می‌شود( پایین، تصویر کانونی میکروسکوپی).‌این الکترود‌ها gMµEs دارای ارتفاع 1.42 um هستند. B,c تحریک و ثبت AP‌ها و پتانسیل‌های زیر سرحد که با استفاده از gMµEs ‌ها با نسبت سیگنال به نویز مشابه با الکترود‌های شیشه‌ای تیز و ریز پپتید‌های اتصالی، به دست می‌اید. قسمت سبز نشان دهندهتزریق جریان به نورون‌ها است؛ قسمت قرمز نشان دهندهثبت میان سلولی با استفاده از ریز الکترود‌های شیشه‌ای است، قسمت آبی نشان دهندهثبت‌های درون سلولی با استفاده از آرایه‌های عمودی نانو سیم‌ها(VENA) می‌باشد که می‌تواند e را تحریک کرده و f را از AP‌های تک فاز نورون‌های کورتکس ثبت کند. V_prولتاژ‌های اتصال، V_nw ولتاژ‌های ثبت نانو سیم‌ها می‌باشد. G-i نیز یک نانوتیوب سیلیکنی است که با فسفولیپید روی آن عملیات انجام شده است که به عنوان الکترود‌های دستگاه‌های ثبت FET برای ثبت AP‌های کاردیومیوسیت با نسبت سیگنال به نویز مشابه با الکترود‌های شیشه‌ای از آن‌ها استفاده می‌شود. G یک تصویر SEM از دستگاه (سمت چپ) و الکترومیوسیت‌های رشد یافته روی آن می‌باشد (سمت راست). h ثبت‌های نانوتیوب‌ها قبل از ثبت پتانسیل‌ها به صورت درون سلولی می‌باشد.

جدول 1 روش‌های ثبت و تحریک سیگنال‌های الکتریکی

طبیعت فیلتر سازی سیستم‌های ثبت را می‌توان عکس کانوالو گرفت و ازین رو ثبت‌هایی با کیفیت بالا از AP‌ها و پتانسیل‌های سیناپسی را به دست آورد. یک تزویج الکتریکی پایدار بین gMµEs و نورون‌ها با‌ایجاد حلقه‌های اکتینی اسکلت سلولی اطراف ساختار‌های قارچی شکل الکترود‌ها،‌ایجاد می‌شود (شکل 5a، قسمت پایین). هر کدام از الکترود‌ها gMµEs امکان ثبت و تحریک جریان‌های کاربردی‌ایجاد می‌کند. تا کنون، تلاش‌هایی انجام شده است تا بتوان ثبت‌ها و تحریک‌های الکتریکی را در نورون‌های هیپوکامپ موش و کاردیومیوسیت‌های اولیه انجام داد که‌این تلاش‌ها خیلی موفق نبوده است. باید به‌این نکته اشاره کرد که در هر صورت‌این تلاش‌ها محدود به gMµEs اصلاح شده با پلی دی لازین بوده است در حالی که ما از پپتید‌ها استفاده کرده‌ایم که قابلیت‌های بهتری دارد.

نانوستون‌ها برای ثبت‌های درون سلولی و تحریک‌ها

الکترود‌های تیز شیشه‌ای (شکل 4a) و الکترود‌های اتصالی(شکل 4b) ثبت‌های درون سلولی مفیدی را با نفوذ در غشای پلاسمایی و دسترسی مستقیم به سیتوزول‌ها‌ایجاد می‌کند در حالی که با غشای پلاسمایی R_seal موثری را‌ایجاد می‌کند ( صدها MΩ تا چند GΩ که در جدول 1 نشان داده شده است). یکی از مطالعه‌های اخیر از آزمایشگاه‌های Park از آرایش‌های الکترودی نانوسیم‌ها (VENA) استفاده کرد که از هسته‌های سیلیکنی ناخالص شده با دی اکسید سیلیکن و نوک‌های Ti/Au استفاده کردند تا بتوانند پیکربندی مشابه با الکترود‌های تیز درون سلولی‌ایجاد کنند ( شکل 4f و5d). در‌این مطالعه، آرایه‌های 3 x 3 به صورت 9 نانولوله با قطر 150 nm، ارتفاع 3um و گام 2 um بر روی 16 پد حسگر قرار داده شدند . نورون‌های کورتکس موش‌های آزمایشگاهی و یا سلول‌های HEK293 سپس بر روی VENA‌ها به مدت چند روز کشت داده شد. حدود 50% از VEA‌ها به صورت خود به خود داخل غشای پلاسمایی سلول‌های HEK293 نفوذ کردند زیرا جریان‌های تزریق شده درون VENA‌ها یک افت ولتاژ در غشای پلاسمایی‌ایجاد کرده بود. در شرایطی که نفوذ‌های خود به خودی در غشا مشهود بود، یک پالس منفذ سازی الکتریکی ( تقریبا +-6 V, 100ms) برای نفوذ به غشای نورون‌ها اعمال شده بود. تاثیر‌این پالس‌های منفذ سازی الکتریکی بر روی غشا نشان داده
شده است. مقاومت بست‌ایجاد شده بین VNEA‌ها و غشای پلاسمایی حدود 100-500 MΩ تخمین زده شده است . VNEA‌ها در دو حالت مورد استفاده قرار میگیرد: در حالت فارادیک، که یک بایاس -1.5V بر روی نانوسیم‌ها اعمال می‌شود و مقاومت دسترسی تا حدود 300 NΩ کاهش پیدا می‌کند و در ناحیهخازنی ، زمانی که هیچ بایاسی وجود ندارد که مقاوت دسترسی نیز در‌این شرایط بی نهایت می‌باشد. بر همین اساس، در ناحیهفارادیک تزویج الکتریکی برای AP‌ها بین سلول‌ها و VNEA‌ها حدود 10% است در حالی که در ناحیه خازنی تضعیف بیشتر است، و گاهی تزویج‌های 0.1 تا 0.3 % می‌باشد ( جدول 1).

مطابق با قرار گیری میان سلولی در VNEA‌ها، تمام AP‌های ثبت شده تک فازی می‌باشد ( همانطور که در مرجع 18 و 70 بیان شده است). اما، ضریب تزویج و نسبت سیگنال به نویز برای‌ایجاد ثبت‌ها در پتانسیل‌های زیر سرحد کافی نمی‌باشد. در واقع، در رابطه با معیار‌های ارزیابی که در بالا ذکر شده است، ثبت‌های به دست آمده از VNEA فایده زیادی را نسبت به gMµEs که خارج از سلول‌ها قرار گرفته است در نورون‌های کشت یافته در هیپوکامپ،‌ایجاد نمی‌کند. ضریب تزویج نسبتا ضعیف در سنسور‌های مبتنی بر VNEA تقریبا به دلیل امپدانس بالایی از VNEA‌ها می‌باشد (جدول 1). فایدهثبت‌ها با استفاده از VNEA‌ها نسبت به روش‌های الکترود‌ها صفحه‌ای بستر کلاسیک ( جدا از الکترود‌های کوچک)‌این است که‌این پد‌های حسگر AP‌هایی از یک نورون را ثبت می‌کند. با وجود‌این که Robinson و همکارانش تاکید بر کارایی VNEA‌ها برای حل مشکل نورون‌های منفرد توسط تحریک‌های الکتریکی و ثبت پتانسیل‌های سیناپسی با الکترود‌های اتصالی دارند، باید به‌این نکته اشاره کرد که انواع مختلف از صفحه‌های الکترودی خارج سلولی(شکل 4c) و ریز الکترود‌ها هم می‌توانند به خوبی سلول‌های منفرد را تحریک و یا ثبت کنند. به عنوان مثال، Hofman و همکارانش یک نانومحفظهپر شده با مایع‌ایجاد کردند ( با ارتفاع 50nm) که با استفاده از مایعی که‌این محفظه را پر کرده است به صورت یک الکترود با امپدانس کم تبدیل می‌شود. اتصال عملکردی‌این سلول با الکترود از طریق منفذ‌هایی با قطر کمتر از یک سلول،‌ایجاد می‌شود.‌این پیکر بندی موجب افزایش تفکیک فضایی MEA‌ها شده و R_seal ‌ایجاد شده بین سلول‌ها و دستگاه افزایش پیدا می‌کند. پیکربندی سلول و نانومحفظه‌ها امکان ثبت FP‌ها تک فاز با دامنه بیشتر از 1mv را ممکن می‌سازد. با استفاده از آرایه‌ای از الکترود‌های تنگستن که به صورت ریز الکترود‌ها دیده میشوند و دارای ضخامت 600-nm می‌باشد، Huys و همکارانش FP‌های منفی دو فازی در گستره50-100 µW را ثبت کردند .‌این ریز آرایه‌ها همچنین امکان تحریک موثر سلول‌های منفرد را فراهم کرده است.

ثبت‌های میان سلولی با استفاده از منفذ سازی‌های الکتریکی

همانطور که توسط Robinson و همکارانش بیان شده است، تنها کسری از نانو سیم‌ها به صورت خود به خود در غشای پلاسمایی نفوذ میکنند. در هر صورت، کاربرد‌های جریان از طریق ستون‌های نانو می‌تواند موجب نفوذ آن‌ها در غشای پلاسمایی شود.

شکل 6 ثبت‌های خارج سلولی پتانسیل‌های میدان و ثبت‌های درون سلولی و فرآیند‌های بازیابی

 قبل از منفذ سازی الکتریکی، یک gMµEs برای ثبت FP‌های خارج سلولی کاردیومیوسیت استفاده می‌شود (a، (i)؛ در تصویر b بزرگ شده است (i)) بعد از تحویل یک پالس منفذ سازی الکتریکی می‌شود 100ms, 1v ( در صفر ثانیه) که حالت دو فازی دارد که به صورت یک پتانسیل تک فازی 5mV با شکلی مشابه ثبت‌های درون سلولی دیده می‌شود. دامنهAP ‌ها در طول زمان 125-148 S به تدریج کاهش پیدا می‌کند و شکل FP خارج سلولی بعد از منفذ سازی الکتریکی را نشان میدهد. ازین جا به بعد شکل FP به صورت تدریجی بازیابی می‌شود( بین زمان‌های 148-607 s، که در b، i-iv بزرگ شده است) که به صورت شکل دو فازی عمومی بازیابی می‌شود(a (iv) و b (iv)). بزرگ نمایی FPها قبل از منفذ سازی الکتریکی (i) و زمان (148s (ii)، 607s (iii) و 24h ) iv) بعد از منفذ سازی الکتریکی. طراحی‌های شماتیک تاثیرات معکوس پذیر در نظر گرفته شده از پالس‌های منفذ سازی الکتریکی بر روی غشای پلاسمایی در مقابل یک gMµEs دیده می‌شود.

چهار مطالعهاخیر نشان داد که برای اولین بار غشایی که به صورت موضعی تحت منفذ سازی الکتریکی قرار داشته است می‌تواند موجب ثبت درون سلولی AP‌های تضعیف شده بشود. Xie و همکارانش نشان دادند که‌این منفذ سازی الکتریکی در سلول‌های کاردیومیوسیت‌های کشت یافته توسط الکترود‌های نانو ستونی چگونه است. Hai و Spira، و Fendyur و Spira منفذ سازی الکتریکی نورون‌های آپلیزیا و سلول‌های کاردیومیوسیت را به ترتیب با gMµEs نشان دادند. علاوه بر‌این Breaken و همکارانش نیز با استفاده از الکترود‌های TiN در سایز میکرومتر، منفذ سازی‌های الکتریکی را نشان دادند. در‌این چهار مطالعه دسترسی‌های درون سلولی با بیان‌این که‌این منفذ سازی‌های الکتریکی مکانیزم‌های ترمیم را‌ ایجاد می‌کند که منفذ‌های‌ایجاد شده به صورت الکتریکی بسته می‌شود، به عنوان دسترسی‌های گذرا تعریف می‌شود که موجب می‌شود دسترسی نانو لوله‌ها و یا نانو الکترود‌ها قطع شود( تصویر 6). ددر‌این مطالعه‌ها، پالس‌های منفذ سازی الکتریکی موجب کاهش مقاومت غشای اتصالی به صورت کافی می‌تواند FP‌های دو فازی کاردیومیوسیت‌ها را به پالس‌های مثبت تک فاز 1-11mV AP تبدیل می‌کند. شکل AP‌های تضعیف شده در اصل پتانسیل‌های کاردیومیوسیت می‌باشد.

پاسخ گذرای‌این تزویج‌های الکتریکی و تضعیف AP‌ها نشان میدهد که‌این منفذ سازی‌های الکتریکی نمی‌تواند روشی برای بهبود سطح مشترک بین MEA‌های میکرو الکترودی و غشای سلول باشد. در هر صورت نشان داده شده است که می‌توان جوش‌های بین الکترود و غشا را‌ایجاد کرد و یک مقاومت بست در حد GΩ نیز با استفاده از عملیات مناسب بر روی سطح الکترود‌ها با استفاده از عامل‌های مبتنی بر لیپید‌ها‌ایجاد می‌شود. جالب است که در نظر داشته باشیم روش‌های نانولوله‌ها نمی‌توانند فایدهزیادی نسبت به الکترود‌های خارج سلولی صفحه‌ای‌ایجاد کنند زیرا پتانسیل‌های ثبت شده حداقل یک مرتبه در اثر امپدانس بالای ذاتی و R_seal ناکافی، کاهش پیدا می‌کند. همچنین باید‌این موضوع را در نظر داشت که حتی در صورتی که یک پد حسگر منفرد چندین نانولوله را حمل کند، تعدادی از آن وارد غشای پلاسمایی می‌شود و امپدانس الکترود‌ها نیز برای ثبت پتانسیل‌های زیر سرحد بسیار بالا هستند ( جدول 1). از نظر تئوری، مشکل امپدانس‌این الکترود‌ها را می‌توان با افزایش تراکم‌این نانولوله‌ها حل کرد . در هر صورت، زمانی که تراکم‌این الکترود بیشتر از یک حد مشخص، موجب می‌شود که‌این نانو لوله‌ها دیگر در غشا نفوذ کنند زیرا تراکم بالای‌این ساختار‌ها مانع نفوذ می‌شود. به عنوان مثال، Bruggermann و همکارانش ساختار‌های نانول لوله‌های طلا با تراکم بالا به صورت عمودی ( قطر 60 nm با ارتفاع 300-400 nm) بر روی پد‌هایی با قطر 15 um‌ایجاد کردند. با وجود‌این که ابعاد‌این ستون‌ها در حد نانومتر بود، سلول‌های HL-1 که به صورت منفی فعال میشدند و بر روی MEA کشت یافته بودند، FP‌های بزرگ منفی تک فاز در حدودmV 1‌ ایجاد کردند. کاملا مشخص است که‌این الکترود‌های نانو لوله‌ای در جایگاه خارج از سلول‌ها قرار گرفته اند. در همین شرایط مشابه، یک پد الکترودی متراکم توانست ولتاژ‌های دو فازی و یا FP‌های تک فازی با دامنهبزرگ را بین الکترود‌ها و غشای پلاسما ثبت کند که همین موضوع نشان میدهد تراکم بالای‌این الکترود‌ها مانع نفوذ آن‌ها به غشای پلاسمایی شده است. ازین رو، بهینه سازی تعداد ستون‌ها، برای کاهش تاثیر امپدانس و تراکم‌این ستون‌ها بسیار ضروری است.

غلبه بر محدودیت‌های امپدانسی نانو ستون‌ها

با استفاده از نانوتکنولوژی مبتی بر نیمه رسانا‌ها و استفاده از مفاهیم کلاسیک نفوذ مکانیکی به غشای سلول با استفاده از ریز الکترود‌های شیشه‌ای، منجر شد که آزمایشگاه Lieber ثبت‌های درون سلولی 80-100 mv از AP‌ها را از کاردیومیوسیت‌های ضربان دار ثبت کنند ( شکل 5g)‌این کار یا با نانو سیم‌ها انجام شد و یا از نانو ساختار‌های ستون شکل با استفاده از نانو سیم‌های سیلیکنی ساخته شده است که به عنوان گیت‌های حسگر FET‌ها‌ایجاد شده است.

در کار توصیف شده توسط Tian و Cohen-Karni و همکارانش، یک FET‌ایجاد شده است که دارای نوکی با ابعاد 80 nm‌ایجاد شده است که اطراف آن سیم‌هایی با ابعاد نانو قرار گرفته است. در کار توصیف شده توسط Duan و همکارانش، یک نانوسیم سیلیکنی بر روی گیت یک FET‌ایجاد شده است (شکل 5g). برای تسهیل نفود الکترود‌ها به داخل سلول‌ها، سطح دستگاه‌ها با استفاده از فسفولیپید‌ها اصلاح شده است. جوش خود به خودی اعمال شده با استفاده از فسفولیپید‌ها با غشای لیپیدی در سلول‌ها به نظر موجب‌ایجاد مقاومت بست در حد GΩ می‌شود. با استفاده از هر دو نوع نانوسنسور‌ها، AP‌های کامل قلبی در حد 75-100 mV، در دوره200ms ثبت شده است ( شکل 5h,i). اندازه گیری‌های با کیفیت از AP‌ها در اثر سه عامل‌ایجاد می‌شود : (a) سایز در ابعاد نانو در سنسور‌ها که امکان ورود‌این سنسور‌ها به سیتوزول‌ها از طریق غشای پلاسمایی سلول‌ها فراهم می‌شود (b) تشکیل مقاوت GΩ بین غشای پلاسمایی و نانو ساختار‌ها (c)‌این حقیقت که سایز ناحیهحسگر‌ها تاثیری بر روی حساسیت آن ندارد. باید به‌این نکته اشاره کرد که در حالی که ابعاد سایز‌این نانو ساختار‌ها وایجاد مقاومت بست GΩ برای ثبت‌های با کیفیت ضروری هستند، مهم ترین علت موفقیت ، استفاده از الکترود گیت در FET است که به عنوان یک الکترود حسگر استفاده می‌شود، در حالی که پیش از‌این از الکترود‌های نانو منفعل به عنوان حسگر استفاده میشده است. ازین رو، بر خلاف الکترود‌های منفعل، زمانی که سیگنال‌ها به دلیل خازن‌های گذرا تضعیف می‌شود، یک FET به صورت موثر سیگنال‌ها را در محیط آزمایشگاهی تقویت می‌کند. باید به‌این نکته اشاره کرد که FET‌ها احتمال شکست زیادی دارند زیرا جریان نشتی زیادی دارد در حالی که الکترود‌های منفعل در اثر نقص‌های دستگاه خیلی تحت تاثیر قرار نمیگیرد.

روش‌های استفاده شده توسط آزمایشگاه Lieber قرار دادن نانو ستون‌ها در سلول‌ها استفاده که در‌این روش کاردیومیوسیت‌های بالغ بر روی یک لایهنازک از پلی دی متیلوسیلوکسان قرار میگیرد که رو به پایین است و روی سطح دستگاه قرار گرفته و فشار رو به پایین بسیار کمی بر روی بستر‌ایجاد می‌شود.‌این دستکاری‌ها موجب میشوود که نانوالکترود‌ها در مدت 45s وارد غشای سلول شود. در حالی که اثبات‌این‌ایده در‌این روش توسط آزمایشگاه Lieber فراهم شده است، باید‌این‌ایده باز هم توسعه پیدا کند تا بتوان آزمایش‌ها بر روی کاردیومیوسیت‌ها و نورون‌ها انجام داد و نورون‌ها و سلول‌ها به صورت پیوسته با بستر MEA اتصال داشته باشد و سطح تماس بین سلول‌ها و الکترود‌ها برای زمان طولانی حفظ شود و دیگر نیازی به دستکاری بیشتر نداشته باشد.

زمانی که ما FET‌های درون سلولی انشعابی از نانو لوله‌ها و یک دستگاه‌های نانوالکترودی را به عنوان ابزاری برای بررسی اتصال‌های کاربردی سیناپس‌ها در نظر میگیریم، یکی از مهم ترین مشکلات سطح نسبت سیگنال به نویز در دستگاه می‌باشد. بررسی بعضی از ثبت‌ها نشان داد که سطح نویز بیشتر از 20mV می‌باشد. در حالی است که‌این نویز‌ها به ابعاد نانو FET نسبت داده می‌شود و ازین رو می‌توان با سایز FET آن را کاهش داد، البته دستگاه‌های فعلی نمی‌توانند تفکیک برای ثبت پتانسیل‌های بسیار کم، پتانسیل‌های سیناپسی و نوسان‌های کوچک غشا را ثبت کنند. دیگر مشکلاتی که در‌این زمینه هنوز حل نشده باقی مانده است باید بیشتر بررسی شود تا صحت مطالعه‌ها در مورد پتانسیل‌های استراحت تایید شود.

تکنولوژی‌های MEA‌های صفحه‌ای گیره‌ای – اتصالی

یکی دیگر از زمینه‌های بررسی برای غلبه بر مشکلات مقاومت بالای غشای اتصالی، امپدانس‌های الکترود‌ها و R_seal است که حول MEA‌های مبتنی بر ریز سیال‌ها دیده می‌شود که امکان اتصال به نورون‌ها در شرایط آزمایشگاهی را فراهم می‌کند.‌این روش به صورت گسترده برای اتصال سلول‌ها در حالت تعلیق مبتنی بر مکش سلول‌های منفرد به روزنه‌ها و‌ایجاد مقاومت‌های در حد گیگا می‌باشد. ازین رو،‌این روش خیلی برای مطالعه‌های طولانی مدت مناسب نیست زیرا شبکه‌های اتصالی پایداری‌ایجاد نمی‌شود. اخیرا Martina و همکارانش شروع به کار بر روی روش‌هایی کرده اند که می‌توان از شبکه‌های عصبی در نورون‌ها استفاده کرد. در‌این مطالعه یک بستر اکسید سیلیکنی و یا لایه‌های اکسید سیلیکنی با منفذ‌هایی با سایز 2 تا 4um مورد استفاده قرار میگیرد. هر کدام از ‌این منفذ‌ها به یک کانال ریز سیال متصل می‌شود. دو بدنهسلول مجزا در نورون‌های قابل شناسایی لیمنیا با هم روی‌این منفذ‌ها به مدت 8 تا 12 ساعت کشت یافته اند. در طول‌این زمان بدنه‌های سلول‌ها سیناپس‌های شیمیایی‌ایجاد کرده و به بستر میچسبند تا به صورت خود به خود یک مقاومت بست بالای GΩ ‌ ایجاد کنند. پالس‌های فشار منفی از طریق سیستم‌های ریز سیال موجب شکست در غشای اتصالی می‌شود و یک پیکر بندی گیره‌ای – اتصالی کل سلول‌ایجاد می‌کند. در برخی از آزمایش‌ها پیکربندی‌این اتصالات برای چند ساعت پایدار بوده و ویژگی‌های سیناپس‌های‌ایجاد شده بین دو سلول را می‌توان بررسی کرد. نسبت سیگنال به نویز به دست آمده در دستگاه‌های صفحه‌ای اتصالی – گیره‌ای مطابق با ثبت‌های قدیمی می‌باشد. با وجود‌این که‌این روش امید بخش است، باید به‌این نکته اشاره کرد که سوماتا‌های نورون‌ها به هم چسبیده است اما بر روی بستر خیلی پایدار نمی‌باشد. ازین رو، پیکربندی‌های نورون و دستگاه الگوی رشد پیچیدهنورون‌های پستاندارد را شبیه سازی نمی‌کند اما نزدیک به حالت تعلیق سلول‌ها در ثبت‌های گیره‌ای – اتصالی می‌باشد. زمانی که کاربرد پتانسیل‌های MAE‌های گیره‌ای – اتصالی را به عنوان ابزاری برای بررسی اتصال‌های سیناپسی را در میان نورون‌ها بررسی میکنیم، دو شکل اصلی باید بررسی شود : (a) مدت زمان ثبت احتمالا توسط اتصال نورون‌ها و محلول‌های ریز سیال محدود می‌شود. (شکل 4h)، (b) تراکم سنسور‌ها( منفذ‌ها) احتمالا محدود به سیستم سیال پشتی می‌باشد.

جمع بندی

بر اساس نتایجی که در بالا بررسی کردیم و ملاحظات تئوری، ما تخمین میزنیم که تکنولوژی‌های الکتروفیزیولوژی در ابعاد نانو و میکرو امکان ثبت‌های همزمان، طولانی مدت، چند جایگاهی و درون سلولی و همچنین تحریک لول‌های منفرد را در شرایط مختلف بدن و یا محیط آزمایشگاهی فراهم میکنند که در چند سال آتی احتمالا یکی از روش‌های مورد استفاده عصب شناسان خواهد بود. روش‌هایی که در حال حاضر بهترین پتانسیل برای کاربرد را دارند شامل : استفاده از الکترود‌های زیستی که توسط نورون‌ها در بر گرفته می‌شود و استفاده از نانو ساختار‌هایی که به غشای سلول به صورت ریز الکترود‌های شیشه‌ای تیز نفوذ میکنند . آزمایش‌هایی با استفاده از ساختار‌های نفوذ کننده در ابعاد ستون‌های نانو انجام شده است که در‌این الکترود‌های جدید لایه‌های لیپیدی بر روی‌این الکترود‌ها قرار گرفته است که نشان داد در حالی که نانولوله‌هایی به‌این صورت می‌توانند وارد غشای پلاسمایی شده و R_seal نسبتا بالا‌ایجاد کنند، و نسبت امپدانس نانو الکترود‌ها به R_seal موجب می‌شود که پتانسیل‌های ثبت شده تضعیف شوند و به همین دلیل امکان ثبت دقیق پتانسیل‌های پس سیناپسی و یا نوسان‌های زیر سرحد غشا فراهم نمی‌باشد. به همین منظور تلاش‌هایی انجام شده است تا امپدانس‌های الکترود‌ها با ساخت نانو ستون‌ها بر روی یک پد منفرد انجام شد اما‌این روش‌ها جواب نداد. به نظر میرسد که افزایش تعداد‌این نانوستون‌ها در‌این پد‌ها برای کاهش امپدانس و کاهش نسبت بیان شده، موجب می‌شود که میزان نفوذ‌این سنسور‌ها به غشای پلاسمایی کاهش پیدا کند. به همین دلیل شاید نتوان از الکترود‌های نانو ستون‌ها به عنوان جایگزینی برای الکترود‌های شیشه‌ای برای ثبت‌های درون سلولی از نورون‌ها استفاده کرد. یکی دیگر از مهم ترین محدودیت‌های‌این نانو ستون‌ها نا پایداری پیکر بندی‌های درون سلولی است. تا اکنون، مکانیزمی برای پایدار کردن جایگاه درون سلولی‌این نانو لوله‌ها به صورت رسمی و جدی یافت نشده است.

در طرف دیگر، استفاده از نانوسیم‌های پیچیده شده و یا نانو سیم‌های سیلیکنی شبیه ستون، به عنوان الکترود‌های گیت‌های یک دستگاه FET موجب رفع مشکل امپدانس الکترودی بالا می‌شود( زیرا ثبت‌های FET مستقل از امپدانس گیت است). به دلیل ابعاد نانو، استفاده از نانو سنسور‌های FET می‌تواند ثبت‌های همزمان از بخش‌های زیر سلولی (دندریت‌ها، سوماتا، آکسون، و دیگر موارد) را فراهم کند. محدودیت‌های جریانی‌این دستگاه‌های نانو ستونی FET برای ثبت‌های میان سلولی شامل موارد زیر است : نویز‌های داخلی در نانو FET‌ها و نیاز به دستکاری مکانیکی سلول‌های کشت یافته و بستر را‌ایجاد می‌کند که منجر به تماس فیزیکی با الکترود‌ها و سلول می‌شود. مشکل نویز را می‌توان با تنظیم سایز ترانزیستور و حالت هندسی آن رفع کرد. البته باید محدودیت‌های نویز محیطی گرمایی در محلول‌های الکترولیت‌ها را هم در نظر داشت. بافت‌هایی که برای‌ایجاد سطح مشترک مناسب باید تحت فشار قرار بگیرند را می‌توان با استفاده از مفاهیم توسعه یافته توسط آزمایشگاه Lieber، با روش‌های بهتری مورد بررسی قرار دارد.

تا کنون، MEA‌های مبتنی برgMµE تنها دستگاهی است که امکان ثبت AP‌ها و پتانسیل‌های زیر سرحد سیناپسی را فراهم می‌کند و می‌توان از آن برای تحریک‌های درون سلولی استفاده رد. در هر صورت،‌این تزویج با استفاده از نورون‌های آپلیزیا نشان داده شده است اما هنوز نتوانسته‌ایم‌این روش‌ها را بر روی نورون‌های هیپوکامپ و بر روی کاردیومیوسیت‌های موش پیاده کنیم. قطعا می‌توانیم بگوییم که اصوول زیستی سلول‌ها در تحریک در برگرفتن الکترود‌ها در یک طرف، و استفاده از FET‌ها در طرف دیگر می‌تواند پیکربندی‌های پایدار بین نورون‌ها و الکترود‌ها‌ایجاد کند. زمانی که به‌این اهداف دست پیدا کنیم، می‌توان از‌این دستگاه‌ها در آرایه‌هایی استفاده کرد که از ظرفیت‌های چند گانه و آرایه‌های ترانزیستوری مجتمع با مقیاس بزرگ استفاده می‌کند.

----

این مقاله در سال ۲۰۱۳ در نشریه  بسیار معتبر نیچر  تحت عنوان Multi-electrode array technologies for neuroscience and cardiology منتشر شده است؛ توسط مقاله‌کده ترجمه و در اینجا آورده شده است. برای دسترسی به متن انگلیسی مقاله به اینجامراجعه کنید.